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鹦鹉喙羽症PBFD的临床症状及检测

鹦鹉喙羽症PBFD的临床症状及检测

分类:
疾病防治
来源:美联众合动物医院转诊中心
发布时间:
2018-12-11 14:46:42


1. 北京荣安动物医院
摘要
近年来鹦鹉喙羽症(Psittacine beak and feather disease,PBFD)成为鹦鹉高发疾病之一,对幼年鹦鹉的威胁尤为明显。PBFD临床表型和严重程度呈多样化,包括羽毛异常、呼吸系统疾病、消化系统疾病等。病毒携带个体可能突然死亡,也有可能不表现任何临床症状,所以常规临床诊断存在比较大的难度。本研究对16个鹦鹉血液样本所提取的DNA进行了巢式PCR扩增,证实分子诊断可以准确灵敏地检测和确诊PBFD病例。实验样本中有怀疑临床症状的病例的阳性检出率为71.4%(10/14),略高于已有文献报道。
 
背景
鹦鹉喙羽症,英文全称是Psittacine beak and feather disease,简称PBFD,于20世纪70年代在澳大利亚的凤头鹦鹉上首次发现[1],是临床中幼年鹦鹉的常见病毒性疾病。这一病毒能够感染包括牡丹鹦鹉、虎皮鹦鹉、玄凤鹦鹉、非洲灰鹦鹉、折衷鹦鹉、吸蜜鹦鹉、亚马逊鹦鹉、凤头鹦鹉、锥尾鹦鹉及金刚鹦鹉等60多种鹦鹉[2,3]。其中临床中非洲灰鹦鹉的感染病例很多,这可能与近年来非洲灰鹦鹉成为广受欢迎的宠物鸟儿而被大量繁殖有关。PBFD的病原是喙羽症病毒(BFDV)[4],属于圆环病毒科[5],是一种非常小的单链环状DNA病毒,病毒颗粒直径为14-17nm[6]
这种病毒的传播途径十分广泛,病毒在感染鸟儿数月后便可通过羽粉和粪便向环境释放病毒。鸟儿可能通过呼吸摄入或吃下带毒羽粉或新鲜/干燥的粪便污染的水或食物而感染[1,7,8]。由于这种病毒抗杀灭能力强,可以很容易的通过沾染在人的衣物上,鸟类用具,运输箱,笼子等物品传播给其他个体。母鸟还可以通过蛋将病毒传播给后代[9]。该病毒的主要攻击目标是分裂活跃的细胞,因此其主要影响的是免疫器官、皮肤和羽毛。这会导致免疫抑制以及喙和羽毛的异常生长。针对羽毛的影响是其导致上皮细胞发生凋亡或异常增生[10],产生羽毛的异常脱落或生长[11,12]。异常的情况包括:长期保留不打开的羽鞘;羽毛内的血液无法重新吸收;羽毛呈现短棒状、卷曲、畸形或带有大量恶斑[1,4,13,14]。喙部的异常因物种而差异,并不是所有的个体都会表现出喙部异常[6]。同时该病毒对免疫系统存在抑制。临床上绝大部分PBFD病例并不是由于病毒直接导致动物死亡,而是由于免疫功能抑制引起的继发感染导致动物死亡[6,15]
PBFD有三种不同的表型,不同表型的出现在很大程度上取决于被感染时鸟的年龄[16]。许多患有PBFD的幼鸟常表现出营养不良,这也会影响病程。特急型大多在刚孵化出的雏鸟中表现。主要表现为白细胞减少、贫血、全血细胞减少、肝坏死等异常[17]。大多数的鸟儿在没有表现出任何临床症状迹象时就可能突然死亡[6,18,19]。急型主要表现在1岁以内的亚成鸟。患鸟常表现出精神沉郁,厌食,虚弱和腹泻。免疫抑制导致的常见并发症可能包括肺炎及肠炎[1,12]。羽毛可能会受到影响,通常表现为羽粉减少,羽毛畸形脱落或羽色变化。慢性主要表现在成年个体,常表现为羽毛缺失和畸形,经常随着换羽的发生而进一步恶化[20]。免疫抑制也会引起继发感染等并发症[1]。随着疾病的发展,喙和指甲可能变得非常脆弱。总的来说感染PBFD的个体死亡率非常高。能够给予的治疗很大程度上是支持性治疗,以帮助患鸟增强机体免疫力来抵抗病毒和继发感染。
 
实验材料与方法
取样方法
根据患鸟状况及主人的要求,采用人工保定或ISO吸入麻醉后进行采血,选取贵要静脉或右侧颈静脉进行采血操作。抽取0.1ml左右的静脉血,迅速放置在装有EDTA抗凝剂的1.5ml离心管内,-20℃保存。
DNA纯化
采用Magen公司HIPURE Tissue DNA Kit试剂盒。鸟类血液样本10μl+190μlPBS混匀后,加入20μl Protease K混匀,加入200μlBuffer DL,颠倒混匀3-5次,以最高速涡旋混匀30秒。65℃水浴30分钟,其间偶尔涡旋2-3次。加入200μl无水乙醇,涡旋30秒。将HipuregDNA Mini Column放置在2ml收集管内,全部液体加入柱内,10000×g离心1分钟。弃去收集管内液体,柱内加入500μl Buffer GW1,10000×g离心1分钟。弃去滤出液,柱子内加入650μl Buffer GW2,10000×g离心1分钟。弃去滤出液,柱子内再次加入650μl Buffer GW2,10000×g离心1分钟。弃去滤出液,10000×g离心2分钟。柱内加入40μl预热至70℃的灭菌水,放置3分钟,10000×g离心1分钟。采用Thermo fisher公司生产的NanoDropND2000检测纯化DNA的浓度及纯度。
巢式PCR检测PBFD病毒
第一轮PCR采用Ypelaar等人的方法[21],正向引物为PBFD 2 (5’-AAC CCT ACA GAC GGCGAG-3’) 反向引物为PBFD 4 G (5’-GGT CAC AGTCCT CCT TGT ACC-3’) 扩增产物为病毒基因组V1上的一个718 bp的片段。采用ABI公司的VeritiPCR仪进行扩增反应。反应体系为20μl,引物各12.5 mM,100ng模板DNA,10μlGeneStarStarmix 2× Taqmix,用灭菌水补齐至20μl。反应条件为94℃ 4分钟预变性; 94℃ 30秒, 58℃ 30秒,72℃ 60秒进行41 个循环;紧接着55℃ 30秒, 72℃ 60秒进行4个循环。第二轮PCR的正向引物为PBFD251 (5’-ACT TAC CCT GGG CAT TGT GGC G-3’),反向引物为PBFD609 (5’-GGC GGA GCA TCT CGC AATAAG G-3’) 扩增的产物为一个359 bp大小的片段。反应体系为20μl,引物各12.5 mM,第一轮产物0.3μl,10μlStarmix 2×Taq mix,用灭菌水补齐至20μl。反应条件为94℃ 2分钟预变性; 94℃ 30秒, 67℃ 20秒,72℃ 30秒进行31 个循环;紧接着62℃ 30秒, 72℃ 60秒进行3个循环。
产物的鉴定
采用2%琼脂在8v/cm的参数下进行30分钟电泳,使用北京华恒泰生物科技有限公司生产的DuRed nucleic acid gel stain无毒染料在紫外光下显影。Marker为Genestar公司生产的100bp Plus ladder。将第二轮产物切胶回收,采用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒回收,回收后产物送睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
 
实验结果
本研究共采集鹦鹉血液样本16份,来源于9种共16个个体,包括鹦鹉目鸟类16只,其中紫兰金刚鹦鹉1只,黄蓝金刚鹦鹉1只,折衷鹦鹉1只,塞内加尔鹦鹉2只,肉桂色小太阳鹦鹉1只,鮭色凤头鹦鹉1只,葵花凤头鹦鹉2只,亚历山大鹦鹉1只,非洲灰鹦鹉6只(表1)。其中编号2、7和15的个体为刚购买宠物鸟的健康体检病例。通过临床检测和问询,每个个体表现的详细临床症状见表1,可见不同的病例存在多种多样的临床表现。其中43.8%(7/16)的病例存在呼吸系统症状,主要表现为呼吸窘迫;18.8%(3/16)的病例存在消化系统症状;43.8%(7/16)的病例存在羽毛异常;所有病例未见喙爪异常。其中18.7%(3/16)同时具有2项症状。现今已知死亡率为31.3%(5/16)。
由于PBFD临床症状存在多样化,传统诊断方式无法确证。所以本研究引入了BFDV分子临床诊断方法,通过两轮巢式PCR对病例血液提取DNA样品进行扩增,代表性样本(2号和13号)两轮PCR的产物都进行琼脂电泳后的结果见图1。A和B泳道为2样本扩增产物,可见该病例为病毒阴性。A泳道为阴性样本的第一轮PCR产物,可见少量的非特异性扩增条带,B为阴性样本的第二轮PCR产物,无359bp阳性条带。C和D泳道为13样本扩增产物,可见该病例为病毒阳性。C为阳性样本的第一轮PCR产物,可见清晰的718bp产物条带,D为阳性样本的第二轮PCR产物,可见清晰的359bp产物条带。
 
图1巢式PCR反应后电泳图,M为100bp Plus ladder,A为阴性样品巢式PCR第一轮产物,B为阴性样品巢式PCR第二轮产物,C为阳性样品巢式PCR第一轮产物,D为阳性样品巢式PCR第二轮产物。
 
经过对阳性样品第二轮PCR产物回收后进行测序,测序结果在NCBI网站经过BLAST进行DNA序列比对,扩增产物序列与BFDV基因序列一致比对结果见图2。可以完全确定检测方法正确,检测阳性结果是准确可信的。
 
编号 品种 年龄 呼吸系统症状 消化系统症状 羽毛异常 喙爪异常 死亡 无明显症状
1 折衷鹦鹉 2y - +(呕吐,嗉囊迟缓) - - - -
2 肉桂色小太阳锥尾鹦鹉 4m - - - - - +
3 塞内加尔鹦鹉 20d +(呼吸窘迫) +(剖检肝脏出血点) - - +(就诊前突然死亡) -
4 塞内加尔鹦鹉 20d +(呼吸窘迫) +(剖检肝脏出血点) - - +(就诊前突然死亡) -
5 紫蓝金刚鹦鹉 3y +(呼吸窘迫) - - - +(就诊第二天死亡) -
6 鲑色凤头鹦鹉 1y - - +(羽毛生长异常) - - -
7 葵花凤头鹦鹉 6m - - +(异常掉羽) - - -
8 葵花凤头鹦鹉 3y - - +(啄羽) - - -
9 亚历山大鹦鹉 1y3m +(呼吸窘迫) - - - - -
10 非洲灰鹦鹉 3m +(呼吸窘迫) - - - +(就诊第二天死亡) -
11 非洲灰鹦鹉 3m - - +(大量血羽脱落) - - -
12 非洲灰鹦鹉 4m - - +(多根羽毛脱落) - - -
13 非洲灰鹦鹉 4m +(呼吸窘迫,剖检右肺霉菌病) - +(多根羽毛脱落) - +(就诊前突然死亡) -
14 非洲灰鹦鹉 3m - - +(一根血羽脱落) - - -
15 非洲灰鹦鹉 4m - - - - - +
16 蓝黄金刚 3y +(呼吸窘迫,眼睛分泌物) - - - - -
表1 病例临床症状

 
 
鹦鹉喙羽症PBFD的临床症状及检测
图2.阳性样本测序比对结果
经过对全部16个样本进行DNA提取纯化并进行BFDV巢式PCR检测后,所有样品的检测结果与是否存在临床症状的对比见表2,总体检测BFDV的阳性率为68.75%(11/16)。存在临床症状的病例中PBFD阳性比例为71.43%(10/14)。没有临床症状的病例中PBFD阳性比例为50%(1/2)。
 
讨论
由于PBFD在临床上存在多种多样的症状和表现,不存在特异性的临床症状辅助临床医生进行诊断,可能会存在怀疑PBFD病例症状的个体, BFDV检测为阴性,也可能存在不表现临床症状的个体BFDV检测为阳性。因此采用适当的分子生物学检测技术准确的检测PBFD阳性病例,对临床病例的确诊有着重要的意义及必要性。本实验只需微量的血液,通过巢式PCR的方法即可准确、高效、灵敏的检测确诊临床PBFD阳性病例。对于3、4号样本出现的雏鸟突然死亡情况,检测出BFDV阳性也与PBFD特急性表型相符,及时准确的获得诊断结果也能帮助繁育者做好环境消毒、种群隔离及净化工作。
 
编号 品种 是否存在临床症状 BFDV检测结果
1 折衷鹦鹉 + -
2 肉桂色小太阳锥尾鹦鹉 - -
3 塞内加尔鹦鹉 + +
4 塞内加尔鹦鹉 + +
5 紫蓝金刚鹦鹉 + -
6 鲑色凤头鹦鹉 + +
7 葵花凤头鹦鹉 + +
8 葵花凤头鹦鹉 + +
9 亚历山大鹦鹉 + +
10 非洲灰鹦鹉 + +
11 非洲灰鹦鹉 + +
12 非洲灰鹦鹉 + -
13 非洲灰鹦鹉 + +
14 非洲灰鹦鹉 + -
15 非洲灰鹦鹉 - +
16 蓝黄金刚 + +
表2分子生物学检测结果
 
本实验选取检测的数个病例有其它检测机构之前检测的双病毒检测阴性结果,但所有之前病例送检样本都选用的是拔掉的带有毛囊的羽毛样本。造成这些检测结果为假阴性的原因可能为羽毛样本能提取纯化的DNA浓度偏低及病毒可能在毛囊样本中的滴度偏低有关。这一结论也与Tomasek等2008年得出的实验结果相类似[22],提示在条件允许的前提下应尽量选用血液样本作为分子诊断送检标本。
本实验结果的BFDV的总体阳性率及有临床症状的阳性率68.75%(11/16);71.43%(10/14),都高于之前台湾的检测结果41.2% (68/165);44.3% (62/140)[23]。同时也高出其它国家的总体检出率(日本31.3 %,德国39.2 %)[24]。这一结果可能与本实验的整体样本数量较少有关,或者提示大陆的宠物鸟带毒率偏高。综上所述,建议大陆的鸟类繁育及贸易需要做好严格的种群净化及疫病防控工作。
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